在自然界中，食用菌总是与多种细菌、放线菌、霉菌等共生。分离菌种就是将食用菌与其共生的杂菌分开，通过培养得到纯净且品质优良的菌种。菌种分为母种、原种和栽培种。(一）母种的分离培养

食用菌的母种分离，可以采用孢子分离法、组织分离法和基内菌丝分离法等。1.孢子分离法

孢子分离法是利用食用菌的有性或无性孢子，在培养基上萌发成菌丝，进而培养成菌种的方法。这种菌种生命力较强，但孢子间的个体差异较大，自然分化现象明显，变异程度较高，需要经过出菇试验验证其生产适用性后，才能在生产中应用。

（1）单孢分离法：这种方法是将每个担孢子单独接种于试管中，使其萌发成菌丝体，从而获得纯种。蘑菇和草菇的菌丝通过单孢分离具有结实能力，适合采用此法分离以生产纯种。尽管单孢分离在生产中较少使用且操作复杂，通常还是推荐采用多孢分离法。

（2）多孢分离法：该方法是将大量孢子接种于同一培养基上，让它们萌发并自由交配，以此获得食用菌的纯种。具体的操作方法包括：

①种菇孢子弹射法：选择成熟度适中、无病虫害、出菇均匀且高产稳产的种菇，切去菌盖大部分，用无菌水清洗菌柄，然后以无菌材料吸干水分。在无菌环境中，将种菇倒挂于漏斗下，漏斗覆盖于培养皿上，上端用棉花塞住。培养皿放在铺有纱布的托盘上，静置一段时间，使孢子散落于培养皿中。使用接种针取少量孢子于试管中的琼脂表面或培养皿上划线接种。

②褶上涂抹法：在无菌操作下，选择成熟的菇褶，用接种针轻取表面尚未弹射的孢子，然后在培养基上划线接种。

③钩悬法：取成熟菌盖的菌褶或耳片（如黑木耳、毛木耳、白木耳等），用无菌不锈钢丝（或铁丝、棉线等）悬挂于三角瓶内的培养基上方，避免接触瓶壁或培养基。

④贴附法：在无菌操作下，取一小块成熟的菌褶或耳片，用熔化的琼脂培养基或阿拉伯胶、浆糊等粘贴在试管斜面培养基上方。培养6-12小时后，孢子会落在斜面上，此时将孢子连同部分琼脂培养基移植到新的试管中继续培养。

获得孢子分离的母种后，需进一步提纯复壮。选择生长旺盛、无老化、无杂菌感染的母种试管，转管扩大培养。通常，转管次数不宜超过5次。在确认母种质量后，可进行出菇试验，验证其优良性能，合格后方可用于生产。

多数食用菌，如蘑菇、平菇、凤尾菇、香菇、冬菇和草菇等，都可以通过多孢分离法获得母种。